空間轉錄組測序或將成下一個熱點？10x Genomics已斥巨資壟斷行業(yè)

2016年，來自瑞典卡羅琳斯卡研究所、瑞典皇家理工學院等研究機構的學者們在《Science》上發(fā)文，闡述了一種新的轉錄組學研究技術，并提出了“空間轉錄組學”的概念。雖然他們并不是第一個嘗試將轉錄組測序與空間位置之間實現(xiàn)一一對應的團隊，但是他們給出的解決方案確實是最完善，最接近商業(yè)化的。

這項技術當時并沒有造成巨大的轟動，但總有會慧眼識英的企業(yè)，比如10x Genomics。2018年底10x Genomics將這項技術收入囊中，并在一年的完善和優(yōu)化后將其推向市場。

如今的空間轉錄組學像極了當年的單細胞測序，雖然還處在科研階段，但是已經(jīng)可以展望到其未來的發(fā)展空間。我們現(xiàn)在已經(jīng)看到了單細胞測序技術逐漸從完成概念驗證進入臨床場景，而空間轉錄組學很有可能會成為單細胞測序之后，又一個閃閃發(fā)光的測序技術外延領域。

通常進行的轉錄組學測序過程，是將一群細胞的RNA提取建庫進行測序。這種方法在細胞成分單一的情況下有比較高的指導意義，但是當細胞成分復雜，比如檢測組織樣本時，RNA建庫的過程導致所有細胞的RNA被混在一起檢測，互相干擾，最終的檢測結果只能輸出整個細胞群的平均值，數(shù)據(jù)的精細度大幅降低。與此同時，細胞的定位信息也在建庫的過程中丟失，而實際上，位置背景對于了解組織功能和病歷變化至關重要。

隨后出現(xiàn)的單細胞測序一定程度上解決了互相干擾的問題。不同類型的細胞可以被單獨篩選，然后各自建庫，進行單細胞測序。但是篩選過程需要將細胞打散，所以位置信息還是無法被完整保留。

芯片上的捕獲引物結構

Spatial的空間轉錄組測序原理

空間轉錄組測序的關鍵就在于，解決了空間位置保留的問題。

被放置在芯片區(qū)域內的冰凍組織切片在經(jīng)過H&E染色和成像記錄后，會被進行透化處理，釋放細胞中的RNA。芯片上的捕獲引物的中段設置了帶有獨特標識的條形碼區(qū)域。芯片被劃分為了數(shù)個不同的捕獲區(qū)域，每個捕獲區(qū)域中錨定的引物都帶有不同的條形碼序列。每個區(qū)域對應的組織位置會被記錄下來，然后再進行測序后，通過條形碼將不同區(qū)域的測序結果，映射到對應的組織位置上，最終拼貼形成組織樣品的空間轉錄組圖像。

相比于常規(guī)的測序手段，空間轉錄組測序有幾個明顯的優(yōu)勢：

1.將轉錄組信息與空間信息對應，體現(xiàn)組織內部的異質性：每個區(qū)域獨特的條形碼使測序結果與空間位置形成一一對應關系。雖然暫時還無法精細到單細胞層面，但是這樣的區(qū)域劃分也已經(jīng)足以展現(xiàn)出組織內部不同區(qū)域間的轉錄組差異。

2.不影響對全組織進行全面分析：芯片上捕獲的全轉錄組在同一個反應中完成測序，能有效降低多次重復實驗中的誤差。測序結果如果不按照條形碼歸類，則直接體現(xiàn)的是切片全組織的轉錄組情況，無需再做單獨檢測。

3.為進一步的研究提供指導意見：常規(guī)的轉錄組測序，對后續(xù)實驗的指導仍然停留在全組織層面。而空間轉錄組測序則可以標識出更有價值的研究區(qū)域，引導研究者將組織進一步細分。

完成了空間轉錄組測序的基礎研究之后，研究者們迅速創(chuàng)立了一家企業(yè)，開始嘗試將這一技術量產(chǎn)化。這家企業(yè)的名字定名為Spatial Transcriptomics，也就是空間轉錄組學，可謂是非常簡單粗暴了。

這家公司成立之后非常低調，直到被10x Genomics收購，沒有進行過企業(yè)的宣傳，也沒有任何融資經(jīng)歷，創(chuàng)始人、發(fā)展情況，都一概不知。因此在分析行業(yè)之余，也不得不承認10x Genomics的挖掘能力，能夠從眾多Biotech企業(yè)中挖掘出Spatial這支來自瑞典的潛力股。

2018年12月，10x Genomics公司宣布，已收購位于瑞典的空間基因組學技術開發(fā)商Spatial Transcriptomics。此時代表Spatial Transcriptomics發(fā)言的聯(lián)合創(chuàng)始人Joakim Lundeberg，正是那篇發(fā)表在《Science》的文章的通訊作者之一。對于本次收購，10x Genomics和Spatial雙方都認為，Spatial提供的技術基礎揭示了細胞間的互相作用，幫助研究者們更加接近生物學的全貌。

Visium平臺示例

被10x Genomics收購之后，Spatial的技術平臺被更名為Visium，在10x Genomics內部繼續(xù)孵化。最初，10x Genomics并未公布這次收購的具體細節(jié)。直到2019年8月，10x Genomics遞交招股書，準備在納斯達克上市，這一交易的部分細節(jié)才在招股書中公開。

根據(jù)招股書中的信息，10x Genomics以3860萬美元收購了Spatial，并獲得了Spatial相關的一系列專利、商標和客戶關系。其中僅專利的價值就達到了3690萬美元，而其余的有形資產(chǎn)和無形資產(chǎn)總價值僅約166萬美元。

到2019年12月，10x Genomics宣布收購Spatial一年之際，Visium平臺正式推出，成為了第一款走入商業(yè)化進程的空間轉錄組產(chǎn)品。

在2020年初的AGBT（基因組技術和生物進展）會議上，10x Genomics表示未來將進一步提高Visium的兼容性，尤其是在測序的同時允許用戶在同一樣本上測定蛋白和基因表達，以及對于FFPE（福爾馬林固定石蠟包埋）樣品的兼容。這些新功能都將顯著提升Visium平臺的應用范圍。

就在10x Genomics興奮的規(guī)劃自己的前路時，剛剛進入市場兩個月的Visium受到了后來者的挑戰(zhàn)。就在本次AGBT大會上，ReadCoor也推出了自己的空間轉錄組測序產(chǎn)品RC2。

ReadCoor的技術基礎源于遺傳學泰斗George Church團隊發(fā)明的FISSEQ原位測序方法。這一技術發(fā)明的時間更早，早在2014年George Church團隊就在《Science》上發(fā)表了相關的文章，并隨后在《Nature Protocols》上公布了FISSEQ的詳細步驟。

以這一技術為基礎的ReadCoor，自然受到了一級市場的青睞。A輪融資就獲得了禮來亞洲、維梧資本、德誠資本等知名投資機構參與，融資額達到2300萬美元。經(jīng)過幾年的潛心研發(fā)，ReadCoor在2020年的AGBT大會上正式推出了自己的空間轉錄組測序平臺RC2。在產(chǎn)品發(fā)布前夕還收獲了蘭亭投資領投的2700萬美元B輪融資。

Readcoor的測序平臺RC2

ReadCoor使用的核心技術FISSEQ是一種熒光原位測序技術。RNA本身很小，直接對組織中的RNA進行測序難度很高。因此FISSEQ在樣品制備的過程中會先將RNA反轉錄成cDNA，并接成環(huán)狀，然后使用特定的DNA聚合酶（如Φ29）進行滾環(huán)擴增（RCA），形成體積較大的擴增子。所有形成的擴增子會被相互交聯(lián)，以保證其空間位置不會在測序過程中發(fā)生移動。這樣一來，在測序的每一個循環(huán)中對切片進行掃描，就可以將擴增子的序列信息與空間位置相結合，達到空間轉錄組測序的目的。

相比于Vissium，RC2是個一站式的解決方案，真正將分辨率控制到單個細胞，并且除了RNA層面的轉錄組研究，其檢測的范圍還涵蓋蛋白質和DNA，實現(xiàn)多組學同時檢測。但RC2的缺點也非常明顯，首先整套系統(tǒng)價格昂貴，一臺機器要40萬美元，而且由于高精度的切片掃描需要大量的時間，因此這臺機器的通量非常小，單次分析短則一天，多則數(shù)日，并且最多同時分析四個樣本。這樣的通量規(guī)模勉強滿足科研需求，很難形成規(guī)?；漠a(chǎn)業(yè)。

如果拋開可用性不談，RC2在檢測精度上明顯高于Vissium。盡管缺點也十分明顯的，由于這一技術還處于起步階段，RC2仍然毫無疑問的成為了Vissium最大的潛在競爭對手。

更重要的是，RC2目前已經(jīng)可以支持FFPE樣品的檢測，但是10x Genomics的解決方案還僅支持冰凍切片。對于更廣泛的科研和臨床市場來說，F(xiàn)FPE樣品的存量更大，應用范圍也更廣，顯然代表著更大規(guī)模的市場。

在這一系列原因的推動下，10x Genomics最終決定斥巨資將ReadCoor，這個最大的威脅轉化成伙伴。并且RC2與Vissium之間的技術路線有可能會形成互補，將二者的優(yōu)勢結合，形成一款檢測精度高，并且可用性強的產(chǎn)品。

鎖式探針

10x Genomics的競爭對手還不止ReadCoor一家。另一家公司Cartana也在做類似的產(chǎn)品，使用的方法與Visium和RC2都有些關聯(lián)。Cartana使用特異性的鎖式探針在直鏈cDNA上實現(xiàn)了滾環(huán)擴增。引物上的條形碼區(qū)域可以保證擴增產(chǎn)物的空間定位準確。但是這項技術目前還無法實現(xiàn)轉錄組測序，只能根據(jù)研究方向設計專門的引物。但是這一方法仍然為Visium平臺的發(fā)展帶來了潛在的競爭壓力，10x Genomics也迅速的捕捉到了這一點。

如今這兩個競爭對手已經(jīng)盡數(shù)被10x Genomics收入囊中。2020年10月5日，10x Genomics宣布，將以3.5億美元收購空間多組學平臺ReadCoor，同時還表示自己已經(jīng)在8月以4500萬美元收購了RNA分析技術研發(fā)企業(yè)Cartana。接連兩項大額收購，表明10x Genomics已經(jīng)下定決心，要在空間轉錄組測序方面走的更遠。

完成了對ReadCoor和Cartana的收購后，10x Genomics在空間轉錄組測序市場上，幾乎已經(jīng)沒有了對手。如今Visium已經(jīng)投入市場近一年，國內很多科研解決方案提供商都已經(jīng)上線了空間轉錄組學的研究服務。

在科研服務市場上，貝瑞基因、諾禾致源、百邁客、伯豪生物等企業(yè)都相繼推出了自己的空間轉錄組測序服務。從我們目前采集到的信息看，整體市場處于供不應求的狀態(tài)。無論是好奇心驅動，還是確實對研究有重大意義，科研市場對于這一新技術表現(xiàn)出了濃厚的興趣。

 “其實從2019年初，科研市場就已經(jīng)開始對空間轉錄組這一技術進行相關的宣傳了。大家都覺得這個技術是繼單細胞測序之后，基因測序領域的又一重大突破?！?span style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(255, 129, 36);">諾禾致源的空間轉錄組業(yè)務負責人劉國靜介紹到。

“主要的應用層面還是在科研上，患者樣品、模式動物樣品，現(xiàn)在還發(fā)展到植物的樣品，都可以做?！?span style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(255, 129, 36);">百邁客醫(yī)學業(yè)務單元總經(jīng)理劉敏告訴我們。

Visium主要解決的是轉錄組，也就是mRNA層面的問題。上一級的基因組，和下一級的蛋白組，目前為止已經(jīng)有比較明確的解決方案了。細胞的基因組一般來說區(qū)別不大，因此全基因組測序，或者外顯子組測序，已經(jīng)組以解決基因組層面的問題，不必要考慮空間信息。而蛋白組層面，免疫組化可以實現(xiàn)蛋白組層面的檢測，但是檢測效率有限，一般一張切片只能檢測一個蛋白靶標，而且檢測不同的蛋白需要用特異性的一抗。

由于轉錄組和蛋白表達之間的相關性，高通量的空間轉錄組測序可以為進一步的蛋白組檢測提供指導意見，幫助研究人員從大量的轉錄組數(shù)據(jù)中尋找更可能有價值的蛋白marker。

目前這一產(chǎn)品的定價還比較高，從我們調研的幾家信息來看，單個樣品的檢測價格在4-5萬，包括了從樣品制備到最終數(shù)據(jù)分析的全流程。這一高價狀態(tài)與檢測儀器的成本、試劑耗材成本、還有復雜的樣品制備過程都有關系。但是隨著技術的革新和方法上的不斷改進，相信這一技術最終會像NGS一樣，成為能夠廣泛應用的產(chǎn)品類型。

“從我們現(xiàn)在看來，這一產(chǎn)品的降價空間還是比較大的，未來的發(fā)展空間也很廣闊。Visium現(xiàn)在的功能還僅限于轉錄組，未來如果能擴展到甲基化，或是其他一些影響基因轉錄表達的檢測靶標上，平臺的價值會大幅提升?！眲⒚粽f。

當然在廣泛應用之前，Visium也還有很多問題需要克服。

“這個產(chǎn)品用在科研領域，技術上已經(jīng)相對成熟了，操作難度也不是太高。但是第一，分辨率還有待提升，比如如果能做到單細胞級別，甚至更高的分辨率，就能滿足更高層面上的需求；第二未來這個產(chǎn)品想要廣泛應用，肯定不能只限于冰凍切片，F(xiàn)FPE樣品的檢測是一定要克服的?！眲o說。

劉國靜談到的兩個問題，10x Genomics已經(jīng)在著手解決了。FFPE樣品分析預計在2021年上半年推出。精度方面，Visium已經(jīng)在Spatial的技術基礎上發(fā)生了明顯的提升，從1000多個點上升到了4992個點，未來顯然還會繼續(xù)提升。

對于更深層次的臨床應用，劉敏認為不可操之過急：“從長遠的角度上看，在臨床上的應用肯定是非常有前景的，但可能還需要很長的時間。不止是因為精度和成本方面還達不到進入臨床的水平，更重要的是，臨床上現(xiàn)在對于轉錄組的數(shù)據(jù)積累和研究認知還不夠充分。所以價值肯定有，但是短期內很難走到臨床層面。”

隨著二代測序技術的發(fā)展成熟，尤其是在成本大幅降低之后，二代測序近兩年隱隱有取代PCR、FISH等常規(guī)基因檢測技術的趨勢。比如在今年的新冠肺炎檢測是試劑盒中，華大基因開發(fā)的宏基因組測序檢測試劑盒是最早一批獲批上市的檢測產(chǎn)品之一。

但是另一方面，雖然測序技術已經(jīng)趨于完善，但其在臨床上的應用場景挖掘卻還不夠深入。目前臨床上最直接的應用場景就是腫瘤伴隨診斷和宏基因組檢測兩大方向，檢測目標主要圍繞著基因組展開，小到幾個基因的panel，大到全外顯子檢測。但這些畢竟只是基因組層面的信息，需要經(jīng)過轉錄-翻譯的過程，才能最終體現(xiàn)在腫瘤的表型上。而在轉錄-翻譯的過程中，復雜的調控機制帶來的腫瘤異質性，基因組測序更加無從得知。

空間轉錄組測序的出現(xiàn)為基因測序領域帶來了新的機會。無論是對于上游的測序儀行業(yè)，還是未來為應用層帶來的可能性，空間轉錄組測序都是個值得基因檢測行業(yè)重點考慮的新方向。

在科研行業(yè)中，針對轉錄組的大規(guī)模研究，研究方法主要以PCR-array為主。PCR-array本質上是通過芯片實現(xiàn)的高通量Real-time PCR過程，根據(jù)研究者的需求，可以對要檢測的目標基因進行不同panel大小的定制。這種方法在體外培養(yǎng)的細胞樣品分析上，可以達到比較好的效果，但是當上升到組織層面，PCR-array無法很好的區(qū)分組織的異質性，只能實現(xiàn)混合物的統(tǒng)一分析。

空間轉錄組測序可以比PCR-array更好的滿足科研方面的需求。使用PCR-array的場景往往在于從大量轉錄組數(shù)據(jù)中挖掘潛在的可能性。相比于研究體外樣品，組織樣品更加貼近機體的自然裝填，顯然具有比體外樣品更高的價值。而且空間轉錄組測序還能從空間維度區(qū)分組織內部的異質性，為研究者提供更深度的研究價值。

此前我們在測序儀行業(yè)的分析中就談到過，目前Illumina在全球測序儀市場上已經(jīng)接近壟斷地位。未來國產(chǎn)測序儀如果想要突圍，與應用層合作落地可能是最好的市場拓展選項之一。切到具體應用場景的產(chǎn)品，往往本身并不附帶測序功能，比如單細胞測序、腫瘤伴隨診斷等。如果能與這些檢測產(chǎn)品合作落地，形成一整套完整的分析體系，就可以為使用者提供一整套完整的工作流程。

這一點對于空間轉錄組測序產(chǎn)業(yè)也是一樣的。以Visium為例，Visium本身提供的主要是針對樣品的處理方案，包括組織優(yōu)化試劑盒和空間基因表達試劑盒。而后續(xù)的測序環(huán)節(jié)，則由用戶自己選擇。如果國產(chǎn)測序儀行業(yè)能夠針對空間轉錄組測序進行針對性的優(yōu)化，甚至直接整合成一整套自動化的處理系統(tǒng)，可能有機會搶占這一部分市場份額。

雖然如今談及應用層面還為時尚早，但是空間轉錄組測序為組織內細胞的細分亞型和空間分布給出了新的分析維度，可能會幫助臨床實現(xiàn)更好的患者分子分型。尤其對于Biomarker的挖掘方面，多組學分析中如果可以新增這兩個重要的維度，對于藥物有效群體的挖掘將帶來關鍵性的指導意義。

劉國靜告訴我們，他們已經(jīng)在實際的工作中接觸過一些藥企了：“有些藥企其實已經(jīng)向我們表達過了對這個新技術的興趣，但是具體的合作目前都還在洽談中。他們的訴求是希望能夠通過這項新技術提供的新維度，看能不能發(fā)現(xiàn)一些新的標志物，新的功能細胞群體、新的細胞通訊方式等，能夠在研發(fā)環(huán)節(jié)上幫助到他們。”

新的技術總會帶來新的機會和新的市場。雖然空間轉錄組測序目前為止商業(yè)化才剛剛一年，但是我們已經(jīng)可以看到這項技術未來在臨床上應用的價值。經(jīng)過先后幾次收購，10x Genomics暫時實現(xiàn)了對這一領域的全面掌控，當然我們也希望這一次國內的技術平臺能夠更快速的跟進項目，實現(xiàn)這一領域的全面突破。